引見

- Introduction -

細胞療法的勝利貿(mào)易化須要對產(chǎn)品德量、本錢和創(chuàng)造進程的范圍舉行所有籌備和商量。機動化的實行對于產(chǎn)業(yè)化范圍的妥當且可反復的創(chuàng)造進程至關要害。仍舊開拓了很多用來細胞創(chuàng)造的清洗和濃縮安裝。那些本領源自輸血醫(yī)術、造血干細胞和底棲生物藥劑創(chuàng)造，個中操縱體制與手動離心各別。

這篇綜述刻畫了每個暫時可用的清洗和濃縮擺設的汗青發(fā)源和普通本領，以及它們在細胞調(diào)節(jié)運用中的對立上風和劣勢。領會那些本領的一定屬性和控制性對于優(yōu)化細胞療法創(chuàng)造至關要害。

#02

擺設采用的提防事變

-Considerations in Device Selection -

在確定運用清洗和濃縮擺設時，有幾個要害的商量成分。那些在表 1 中舉行歸納。

表 1. 采用清洗和濃縮擺設時的重要商量成分。

加工訴求

在采用清洗和濃縮擺設時，任何給定創(chuàng)造進程的簡直訴求都將感化計劃進程。清洗和濃縮辦法不妨在創(chuàng)造進程發(fā)端時運用，用來細胞富集。也可用來培植基調(diào)換進程的中央或進程中斷時濃縮細胞懸液用來產(chǎn)物配制和彌補。除去工藝開拓辦法中的商量成分外，擺設還應處置產(chǎn)物的要害品質(zhì)屬性，比方細胞數(shù)目、生機和細胞濃淡?；谧泽w和異體產(chǎn)物的加工訴求各別，擺設采用的商量成分也各別。

（1）自腦細胞

最小處置本領和接收的活細胞百分比是自體產(chǎn)物更加要害的成分，由于細胞接收率低大概引導消費運轉(zhuǎn)波折。當須要濃縮的細胞懸浮液時，最小輸入量也大概是一個要害成分。

用單采資料創(chuàng)造 ATMP 常常須要去除紅細胞 (RBC) 或采用細胞。除去緩沖液調(diào)換外，少許處置擺設（比方 Sepax、Lovo、Elutra 和 Rotea）還不妨去除紅細胞。

常常，人們會采用一種不妨在創(chuàng)造進程中實行多個辦法的擺設，而不是具有兩個獨力的擺設，進而最大控制地普及本錢入股并最大控制地貶低工藝開拓本錢。

（2）異腦細胞

在采用用來處置同種異體產(chǎn)物的擺設時，最大處置本領是一個要害成分。這常常稱為開始資料的輸出體積范疇。暫時商場上可用的清洗和濃縮擺設的輸出體積范疇如圖 1 所示。同種異體產(chǎn)物的輸出體積范疇自小于50mL（比方臍帶血）到1000 L或更多 夸大細胞培植。

圖 1. 暫時可用擺設的細胞處置本領比擬。

感化清洗和濃縮擺設采用的另一個要害成分是處置速度和功夫。當細胞在卑劣擺設中長功夫處置時，對細胞品質(zhì)（比方剪切應力）的任何反面感化城市被夸大，卑劣擺設常常沒有溫度或pH遏制。其余，遭到壓力成分（如轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導、酶消化或細胞采用）的細胞大概對清洗和濃縮惹起的壓力越發(fā)敏銳。

一體化

機動清洗和濃縮擺設常常動作加工鏈的一局部運轉(zhuǎn)；所以，必需事前評價將擺設集成到工藝鏈中。物理集成是指擺設怎樣符合處置鏈并貫穿到其余擺設。當細胞以封鎖辦法變化時，機動化的價格最大化；所以，籌備和評價擺設怎樣彼此貫穿特殊要害。

即使試藥（比方，培植基、冷凍生存劑或緩沖液）已包括在袋子中，則樹立清洗和濃縮安裝大概很大略。袋子是簡直一切處置擺設都扶助的方法。即使彈道尺寸兼容，它們不妨經(jīng)過尖刺端口或無菌焊接貫穿。即使不如許做，則須要在與清洗和濃縮安裝舉行無菌貫穿之前將資料裝入變化袋的特殊辦法。即使這種變化不許經(jīng)過無菌貫穿實行，那么機動化的價格就會大大貶低，由于它被覺得是一個盛開的進程。

理念情景下，濃縮產(chǎn)物也應以封鎖辦法變化到卑劣進程（比方灌裝和配制）。因為純潔室空間常常有限，所以還應商量擺設的占大地積和挪動性。擺設的便攜性是利于的，承諾在屋子之間輸送而無需從新校準。即使擺設未便攜，要害的是要商量從新校準的攙雜性。

軟硬件集成對封鎖化機動化的細胞工藝特殊要害。用會合的電子批次記載包辦手動批次創(chuàng)造和品質(zhì)遏制記載，不妨實行操縱機動化。其余，軟硬件集成不妨擴充到會合體例上的多個擺設，它不妨遏制一切鏈接的擺設并供給及時反應。這種本領在底棲生物藥劑的創(chuàng)造中很罕見。

工藝開拓處事

工藝開拓的目的是開拓一種妥當、可反復的工藝，該工藝不妨在維持產(chǎn)品德量和滿意禁錮訴求的同聲舉行臨床消費。妥當?shù)那逑春蜐饪s工藝是一種不管輸出資料怎樣變革都具備最小妨礙率的工藝。實行這一目的波及提防的擺設采用和完全優(yōu)化的和議?？煞磸偷倪M程是爆發(fā)可猜測截止的進程。

理念情景下，開拓的過程還應商量商品本錢，以保證產(chǎn)物在加入商場時利于可圖。商品本錢常常是指爆發(fā)的制形成本，比方原資料、處事力和品質(zhì)遏制嘗試。ATMP開拓進程中爆發(fā)的其余本錢囊括臨床考查、禁錮接受和經(jīng)營銷售的本錢。購置清洗和濃縮擺設、一次性處置套件和連接保護的本錢入股是與實行機動化關系的少許鮮明本錢。徑直比擬各別清洗和濃縮擺設的本錢入股和耗費品本錢大概無助于于擬訂本領的計劃。

#03

機動化清洗和濃縮的暫時本領

-Current Technologies in Automated Wash-and-Concentrate-

以次局部精細引見了暫時商場上可用的清洗和濃縮擺設的工程安排和處置體制。

臺式離心術

用來清洗和濃縮細胞的慣例離心本領是盛開進程。大概，樣本不妨在細胞變化袋中離心以實行封鎖處置。這種封鎖處置的手動本領大略且具備本錢效率，而且在骨髓移植中很罕見，由于在冷凍生存進步行單采單元的體積縮小。在這種情景下，細胞變化袋無菌焊接到另一個變化袋，在離心進程中手動夾住貫穿管。離心后，將含有細胞的變化袋置于血漿索取器上，在松開手動夾鉗后，將過剩的緩沖液或血漿輕輕壓入新袋中。

一個如許的例子是AutoXpress平臺體例（ThermoGenesis Corp.），它是一種臍帶血/干細胞處置體例（圖 2）。它由安裝和一次性處置套件構(gòu)成。處置套件包括多個小口袋，用來保存辨別的血漿、單核細胞和紅細胞（圖 2A）。臍帶血樣品開始變化到處置套件中，而后安置到擺設中（圖 2B）。而后將該安裝裝入離心桶中并離心以將樣本辨別成血漿、血沉棕黃層和紅細胞層。該擺設經(jīng)過變換旋塞手柄的場所將紅細胞機動啟發(fā)到各自的搜集袋中（圖 2C）。而后將血沉棕黃層啟發(fā)至采集樣品袋和冷凍生存袋。之背工動增添冷凍養(yǎng)護劑。該本領也可用來培植細胞（X-WASH 體例.）。

圖 2. 機動化臍帶血處置。

鑒于離心的本領

鑒于離心的本領是運用最普遍的辨別本領之一。鑒于離心的擺設具備各別的形勢和擺設。已運用于細胞療法的大多是管狀碗型[34]?？v然管狀碗安裝的細胞辨別體制一致，但它們依附各別的體制來保送細胞濃縮物。

由柔性隔閡供給：COBE 2991

COBE 2991 (Terumo BCT) 是由IBM工程師共青團和少先隊于1972年開拓的。這項處事是由工程師喬治 T.賈德森倡導的，他17歲的兒子被確診出患有白血病，并被馬里蘭州貝塞斯達的國度暗疾接洽所當選。當賈德森觀賞國度暗疾接洽所的血庫時，他看到了怎樣離心辨別白細胞以辨別白細胞。這激勵了兩種特殊擺設的開拓：IBM 血細胞辨別器和 IBM 血細胞處置器。IBM的調(diào)理部分厥后于1984年被Cobe Laboratories采購，那些擺設此刻以COBE Spectra白細胞辨別體例和COBE 2991細胞處置器出賣。

最后安排如圖 3 所示，該圖展現(xiàn)了血液或白細胞去除術產(chǎn)物經(jīng)過中心端口加入甜甜圈形處置袋的場所。離心后，細胞和培植基筆直辨別，細胞向處置袋的外層遷徙。而后液壓液體使離心碗內(nèi)的柔性膜伸展，壓在細胞處置袋上，進而將上清液從處置袋的重心排出。

圖 3. COBE 2991 細胞處置器。

迄今為止，COBE 2991的運用在很大水平上僅限于最少操縱的細胞產(chǎn)物，這大概局部是因為可擴充性有限。

表 2. 鑒于離心的擺設歸納。

逆流供給：細胞養(yǎng)護器

Cell Saver（Haemonetics）是 1974 年推出的第一個貿(mào)易血液接收安裝。那些擺設旨在搜集血液、用心理鹽水包辦血漿并濃縮紅細胞以舉行再輸注。這個進程是經(jīng)過鐘形離心室（碗）實行的，個中產(chǎn)生向心力梯度，使紅細胞向離心室的底部和側(cè)面堆積（圖 4A）。一旦紅細胞被濃縮和清洗，細胞就會經(jīng)過回轉(zhuǎn)泵的目標并用過濾的純潔氣氛調(diào)換腔室來保送。

圖 4. 圓筒式離心細胞辨別體例的處事道理。

有幾種血液接收安裝不妨依照一致的道理實行細胞蕩滌和濃縮，囊括 Electa（Sorin Group，Saluggia，意大利）、CATS（Fresenius Kabi，Bad Homburg，德國）和 OrthoPAT（Haemonetics）。一項接洽觀察了運用 Cell Saver 5 從單采產(chǎn)物中辨別單核細胞的情景，實行了大概 90% 的 RBC 去除率和大概 64% 的單核細胞接收率 [54]。將該擺設運用于ATMP創(chuàng)造的一個大概挑撥是產(chǎn)量對立較大，大概不實用于某些自體產(chǎn)物。

由打針器柱塞供給：Sepax 和 Sefia

在80歲月后期，探究了運用臍帶血動作骨髓重修造血干細胞的代替根源的可行性。每個臍帶血單元（50-200 毫升）縮小到大概 20 毫升的規(guī)范體積。機動化和規(guī)范化此進程的須要引導了多種機動化處置擺設的開拓，比方前方提到的AutoXpress平臺，以及邇來來自 BioSafe Systems的Sepax（后因由Cytiva 出賣）。

Sepax 2 是一種用來臍帶血處置的調(diào)理擺設，而具備一致安排的 Sepax C-Pro是一種細胞創(chuàng)造擺設。Sepax 是一種封鎖式機動化處置臺式擺設，安排用來處置臍帶血、骨髓和一致的開始資料。它運用一致打針器的圓柱形筒舉行細胞濃縮和清洗。在其機動細胞辨別和議中，處置室開始繪制密度梯度緩沖區(qū)（圖 4B）。密度梯度介質(zhì)的密度常常約為1.077g/mL，這承諾紅細胞沉降（密度約為1.11 g/mL），同聲將單核細胞（密度約 1.067–1.077 g/mL）維持在懸浮液中。隨后，血樣被吸入腔室，同聲腔室從底部離心。單核細胞和紅細胞經(jīng)過密度差和離心筆直辨別。打針器慢慢排出辨別的層，這引導血漿辨別，而后是單核細胞局部。坐落擺設頂部的光學傳感器檢驗和測定經(jīng)過的實質(zhì)物，并經(jīng)過遏制旋塞歧管將它們導出預先指定的袋子。

該公司還開拓了一種更所有的擺設本子，即 Sefia（圖 4D），它運用與 Sepax 溝通的中心本領。Sefia 不妨經(jīng)過貫串流本領處置大于 10 L 的體積（表 2）。

經(jīng)過貫串處置托付：CARR UniFuge

CARR UniFuge是一個貫串處置體例，含量>1000-L（圖4E）。CARR UniFuge的處事道理與Sefia體例的處事道理一致，都依附于離心筒。細胞會合在圓柱體范圍內(nèi)壁，而上清液經(jīng)過圓柱體的重心，一致于 Cell Saver 運用的體制。重要辨別在乎溢出的濃縮細胞經(jīng)過與流體辨別的通道貫串搜集，進而實行貫串處置。CARR UniFuge Pilot 是該系列中最小的本子，氣缸室面積為 1.7 L。這種最小的輸出面積大概使其不符合早期工藝開拓。該公司已倡導頒布具備較小腔室尺寸 (275 mL) 的減少本子，以滿意早期開拓需要 。

鑒于逆流浪心的本領

逆流浪心安裝的首先觀念和安排不妨追究到1932年，其時Charles Lindbergh 安排了一種安裝來清洗懸浮的紅細胞。1948年，Lindahl通訊了運用逆流浪心體例勝利辨別細胞。爾后，貝克曼儀器公司進一步開拓并出賣了該本領，用來細胞辨別。Beckman安排囊括一個特意的離心術（Avanti J-26 系列和 J6-MI），配有一個淘洗旋子 (JE-5.0)，承諾安置彈道和辨別室（圖 5）。

圖 5. 逆流浪心室的觀念安排。

腔室尺寸

腔室的巨細確定了最大和最小的處置本領。表 3歸納了百般逆流浪心安裝的腔室尺寸和寧靜流化細胞床所需的最小細胞數(shù)。流化床的產(chǎn)生須要腔室內(nèi)的臨界數(shù)目的細胞，個中細胞的碰撞最小化由加入的細胞惹起的回旋效力。流化床的寧靜性跟著細胞數(shù)目的減少而減少 。Rotea 等擺設裝備有攝像頭，可及時評價腔室內(nèi)的細胞床寧靜性，這無助于于過程優(yōu)化。

表 3. 逆流浪心安裝的比擬。

腔室進口安排

Elutra和Ksep系列具備一致的腔室安排，個中細胞進口坐落從窄端貫穿的腔露天部（圖 6A）。Rotea腔室安排的各別之處在乎細胞進口在腔室內(nèi)（圖 6B），這承諾更高的離心速率（表 3）并最大控制地縮小死區(qū)。更高的離心速率也是有益的，由于它承諾細胞以更高的風速和功效在腔室中集聚。

圖 6. 兩個逆流浪心室的安排和進口安排。

縱然逆流浪心本領有那些有出息的上面，但對于這種本領在細胞清洗和濃縮上面的功效的消息仍舊很少。邇來的一項接洽匯報稱，Ksep 400在2鐘點內(nèi)對50 L多才干細胞舉行了清洗和濃縮進程，實行了90%之上的細胞接收率，而且對細胞生機沒有反面感化。另一上面，Rotea不妨蕩滌和濃縮體積小于50 mL的樣本。該接洽匯報稱，處置功夫不到15秒鐘，細胞接收率逼近100%，而細胞生機沒有丟失。那些接洽舉例說領會逆流浪心安裝的大操縱范疇，這是從早期臨床接洽發(fā)達到貿(mào)易消費的理念采用。

鑒于過濾的辨別

過濾運用尺寸排阻進程經(jīng)過多孔構(gòu)造（過濾器）保持較大的顆粒，同聲承諾較小的顆粒經(jīng)過。過濾已運用于普遍的行業(yè)，囊括食物、資料和方劑創(chuàng)造。制藥行業(yè)常用的過濾本領有三種：常流過濾（NFF）、切向流過濾（TFF）和回旋膜過濾。

常流過濾

NFF也稱為死端過濾，是最基礎的過濾情勢，個中輸出資料從過濾器的一側(cè)傳播到另一側(cè)（圖 7A）。NFF是一種財經(jīng)高效的本領，用來在溶液含有目的產(chǎn)物的底棲生物創(chuàng)造中去除細胞或細胞碎片。當樣本中液體含量的百分比擬低時，這種本領最靈驗，由于高液體含量會引導膜阻礙（結(jié)垢）。對于細胞調(diào)節(jié)運用，NFF最常用來成果間充質(zhì)基質(zhì)細胞 (MSC)，以在酶解后從細胞中辨別微載體。

圖 7. 底棲生物加工中各別過濾形式的比擬。

切向流過濾

TFF是一種動靜過濾本領，個中輸出資料以平行流進猜測過濾膜，進而最大控制地縮小膜傳染（圖 7B）。一項運用TFF舉行MSC成果的接洽表白，優(yōu)化后的細胞接收率勝過80%。Kaneka細胞濃縮蕩滌體例是為細胞創(chuàng)造開拓的最新 TFF 擺設之一。它具備附加功效，比方用來酶消化的中央袋和可編制程序流體路途，這使其變成脂肪構(gòu)造根源的 MSC 處置的理念采用。

TFF體例的題目之一是膜盒體例內(nèi)大概爆發(fā)跨膜壓力的變革，這大概會引導妨害性剪切力。瓜代切向流 (ATF) 體例是TFF的一種變體，已在細胞搜集臺灣中國廣播公司受歡送。ATF體例不像TFF那么運用單向震動，而是承諾流體在中空纖維膜上往返震動，進而普及功效。貿(mào)易ATF體例的一個例子是XCell ATF，它不妨從1 L夸大到2000 L（表 4）。

表 4..鑒于過濾的細胞濃縮體例的歸納。

紡絲膜過濾

紡絲過濾膜體例囊括容器內(nèi)的圓柱形膜。輸出資料裝入容器和膜之間的環(huán)形間歇中。兩個專心回旋圓柱體間歇內(nèi)的流體能源學被刻畫為 Couette 流。犯得著提防的是，當內(nèi)圓柱體的回旋到達閾值速率時，會爆發(fā)稱為泰勒水渦的環(huán)形水渦 。而后經(jīng)過環(huán)形間歇中的膜回旋產(chǎn)生泰勒水渦來激動過濾（圖 7C）。

第一個商用回旋膜過濾安裝是Biodruckfilter（Sulzer）和 Benchmark回旋底棲生物過濾安裝（Membrex Inc），它們是為底棲生物本領行業(yè)開拓的。這兩種擺設都不是可擴充的，由于它們囊括單個圓柱體而且過濾表面積限于圓柱體的壁。隨后經(jīng)過運用多盤或多軸樹立最大化過濾表面積來實行夸大回旋膜過濾體例的后續(xù)開拓?？v然如許，單缸安排仍舊是血漿置換和細胞調(diào)節(jié)創(chuàng)造的國家棟梁。

在1980歲月，多孔中空纖維血漿過濾被提出動作血漿置換離心體例的一種更大略、更廉價的代替本領。但是，因為血小板和紅細胞集聚以及膜傳染引導浸透壓減少，中空纖維過濾功效常常較低。1985年引入了鑒于回旋膜的血漿置換術，大大普及了血漿搜集的功效。該本領隨后被 Baxter 貿(mào)易化，并開拓成一種機動化細胞清洗和濃縮擺設Cytomate（2010年停產(chǎn)）。

爾后，這項本領以Lovo的情勢進一步興盛，這是一種回旋膜清洗和濃縮安裝，不妨在不到30秒鐘的功夫內(nèi)處置 500 毫升的資料。Lovo不妨實行RBC和免疫性磁珠去除、緩沖液調(diào)換和體積縮小。犯得著提防的是，Lovo的最小輸入體積為50 mL，這對于輸出體積小于100 mL的運用大概并不理念（表 4）。

鑒于低聲波的擺設

低聲波本領的新穎運用始于1917年的潛艇探測。厥后創(chuàng)造低聲波可用來醫(yī)術成像、食物加工、廢水處置和底棲生物加工。低聲波不妨按照顆粒的密度辨別顆粒，由于密度較高的顆粒目標于在低聲波場中向壓力節(jié)點挪動，而密度較低的顆粒向壓力波腹挪動（圖 8A）。將粒子推向壓力節(jié)點的力是重要的聲學歷，它引導粒子在聲場中集聚并產(chǎn)生帶。具備較泰半徑的顆粒在給定的顆粒密度下具備較高的低級聲學歷，而后承諾進一步辨別顆粒。次級聲力強加在粒子帶內(nèi)，按照兩個粒子的重心線與波的目標之間的觀點，啟動粒子相互鄰近或離開。當觀點介于54°和90°之間時，顆粒會彼此招引（圖 8B），產(chǎn)生團簇，最后從懸浮液中積淀出來（圖 8C）。

圖 8. 低聲波效率下細胞濃淡表示圖。

自1990歲月此后，仍舊開拓了很多鑒于聲學的細胞辨別安裝。換能器用來在一側(cè)爆發(fā)直觀低聲波，在另一側(cè)曲射以爆發(fā)聲波場。當聲力到達臨界強度時，細胞或顆粒被困在駐波中，產(chǎn)生積聚的簇，而后積淀。當開始資料具備對立較高的細胞密度或波及大細胞時，鑒于聲學的細胞辨別最靈驗，由于細胞簇的產(chǎn)生是積淀的要害。

暫時，有少許對準各別處置辦法的市場銷售聲學擺設（表5）：BioSep（Applikon Biotechnology）、Cadence聲學辨別器（Pall Life Sciences）和Ekko（FloDesign Sonics）。

BioSep安排為貫注培植體例的一局部，用來懸浮細胞和舉行培植基調(diào)換。所以，那些體例中的處置速度對立較低。Cadence 聲學辨別器專為細胞搜集和培植基廓清而開拓，最大處置速率為3.6 L/h（表 3）。該體例的一個缺陷是它以 2×107個細胞/mL 的最小輸出細胞密度運轉(zhuǎn)，這遠高于細胞創(chuàng)造擴大與增加中斷時的典范培植密度。

Ekko是一種新開拓的細胞處置擺設，它克復了保守聲學擺設的少許題目。Ekko體例具備特殊的腔室安排，個中細胞經(jīng)過兩側(cè)的流體進口加入并進取挪動。而后，細胞遭到由私有壓電安裝爆發(fā)的多維聲駐波的感化。腔室安排經(jīng)過貫串重力、流體阻礙以及低級和次級聲力使細胞會合最大化，進而承諾“捕捉”低密度細胞，比方淋巴液細胞。同樣的擺設也正在開拓用來細胞采用和貫注培植和議的培植基調(diào)換。

表 5. 聲學器件處置本領匯總。

#03

挑撥和將來目標

- Challenges and Future Directions -

縱然有多種清洗和濃縮擺設可供探求機動化這一步創(chuàng)造進程的用戶運用，但創(chuàng)造需要與可用本領之間仍舊生存宏大差異。按照少許邇來接受的產(chǎn)物的規(guī)格，大普遍清洗和濃縮擺設不妨供給所需的細胞濃淡和體積范疇。縱然如許，兒科符合癥大概須要低至1.2×106個細胞的劑量，這遠低于暫時可用的清洗和濃縮擺設的操縱范疇。

普遍來說，新一代清洗濃縮擺設更受歡送，由于它們占用空間更小、容易運用和軟硬件扶助。要害的是要記取，進程開拓須要洪量的全力。Sepax和Sefia等擺設是鑒于離心的體例，其處置參數(shù)一致于臺式離心術體例。所以，過程開拓越發(fā)直覺，特殊符合體味不及的共青團和少先隊。Lovo體例大概利于于兒科運用，在那些運用中須要去除DMSO，并且細胞數(shù)目偶爾很少。Ekko體例最符合處置具備大聲學比較度（比方，微載體）和高細胞密度（比方，單采單位）的資料。Rotea體例在機動化編制程序上面具備很大的精巧性，這對蓄意按照本人的需要定制過程的人很有吸吸力（比方，類器官處置或?qū)⒓毎麧饪s至>300×106個細胞/mL）。

基于仍舊開拓了一系列清洗和濃縮擺設，該范圍的將來興盛大概會以更精巧和定制的處置套件的情勢展示，而不是開拓新式擺設。估計將來的興盛也將激動調(diào)節(jié)開拓商和行業(yè)協(xié)作搭檔之間鞏固協(xié)作，以在細胞創(chuàng)造上面提出革新處置計劃。

Reference:

Advances in automated cell washing and concentration,

doi:10.1016/j.jcyt.2021.04.003

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